味方キャラ
ルイージ
マリオの双子の弟で、今作の主人公。
臆病な性格で特にお化けが苦手。
真夜中に自宅で寝ていた時に発生したテレビの雑音で目を覚ましテレビに近づくと、突如現れたオヤ･マー博士に無理矢理ダークムーンの欠片回収の任務を託される。
前作同様に怯えながらも再びオバキュームを手に数々の屋敷を冒険することになる。 ちなみに今作のルイージの住居は、前作のエンディングで建築・購入したと思われるランクDのマンションである（ランクAのマンションはGC『マリオカート
ダブルダッシュ!!』のコース・ルイージサーキットに登場している）。また、前作でキングテレサから送られた幻の屋敷までの案内地図も部屋に飾っている。
オヤ・マー博士
前作でも登場した、少し変わり者の研究者。
今作ではオバ渓谷にて日々オバケを研究する"オバケ学の権威"となっている。キングテレサが再び現れるまでは、オバ渓谷で仲間のオバケ達とともに平和に過ごしていた模様。
今作でも自身の発明品やベースラボで得た情報を提供するなどしてルイージのサポートを行うが、その一方でオバケ絡みの冒険を嫌がる彼に無理矢理屋敷の調査をさせるなどやや強引な面が強くなっている。
キノピオ
オヤ・マー博士の助手として登場。
キングテレサのダークパワーによって絵画の中に閉じ込められた。
カラーリングがそれぞれ赤・黄・青・紫・緑の計5人が存在し、絵画を「ダークライト」で照らすことで救出が可能。
マンションの様々な場所におり、時には謎解きにおいて重要な役割を果たすこともある。
マリオ
お馴染みルイージの双子の兄。
前作ではキングテレサによって絵画の中に閉じ込められたが、ルイージの活躍により無事救出された。
しかし、今作でまたもキングテレサに絵画の中に閉じ込められ、拉致されてしまう。
前作では最初からマリオを救い出すことが前提で物語が進んだが、今作では物語の後半において初めてマリオが捕まったことが判明する。
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